清華開發高通量干細胞微球3D打印機，并揭示干細胞的再生修復機制
據統計，中國每年因為交通事故等意外傷害導致的死亡人數約為 10 萬人。其中，大面積組織器官創傷是致死的原因之一。
另外，中國每年約有 2000 萬人遭遇不同程度的燒傷，5% 左右的受傷者需要住院治療，以對受傷組織進行修復。
但是，如何實現大面積組織器官的有效再生修復，依然是臨床上懸而未決的難題。
作為人體的“原材料”，干細胞可以產生所有具有特殊功能細胞。它具備多向分化的潛能，通過定向誘導可以分化成特定的組織或器官，具備良好的再生修復能力。
當前，臨床主要采用干細胞注射法，來對器官進行再生修復。即通過提取臍帶血內的間充質干細胞，制備成干細胞懸液，然后將懸液注射到受損的器官部位，從而實現修復。
然而，這種方法的細胞留存率較低。注射幾小時后，干細胞在體內的留存率小于 5%[1]，干細胞活性也會迅速下降，難以滿足臨床對于干細胞數量和質量的要求。
在臨床上，每平方厘米的受損器官需要約 100-300 萬干細胞，并且干細胞的干性需要維持在 90% 以上。
此外，間充質干細胞一般來源于臍帶血、脂肪、骨髓等原代組織，存在擴增效率低、擴增周期長、耗時久等特點。
總體來說，干細胞在向臨床轉化的過程中，依舊面臨著質量不可控、留存效率低、價格高昂等問題，極大地阻礙了產業化的進程。
此前，學界已經研發出若干對策。比如，將干細胞固定在生物活性支架上，從而提升干細胞的穩定性和留存率。
而對材料進行改性設計、以及修飾功能基團，能讓生物活性支架充分地模擬人體內部的細胞外基質微環境，為干細胞生長提供良好的“土壤”。
此外，采用干細胞微球填充式移植法，可以提升營養物質在生物活性支架內部的運輸效率，為干細胞生長提供更豐富的營養物質。
生物 3D 打印技術，也是人們想到的對策之一。它是一種新型的增材制造技術，可以實現生物活性因子、細胞、生物支架在三維空間下的有序排列，提升放生器官的制備效率，并能降低人為因素對于組織器官構造的影響，有望解決器官短缺、供體不足、以及大面積創傷后的原位再生修復等難題。
然而，當前的生物 3D 打印技術對于“生物墨水”的可打印性要求較高。粘度較高的“生物墨水”可打印性更佳，但是生物活性較差；而粘度較低的“生物墨水”的生物活性更優，也能促進細胞的生長、增殖與分化，但是機械性能較低，難以實現對軟組織的生物 3D 打印。
破局：清華團隊研發噴氣式高通量干細胞微球 3D 打印機
為解決上述問題，清華大學深圳國際研究生院生物醫藥與健康工程研究院副教授馬少華和團隊，研發出一款噴氣式高通量干細胞微球 3D 打印機，并提出高密度干細胞微球間隙式的移植技術。
（來源：Nature Communications）
目前，課題組正準備與多家醫院開展合作，打算試點投放這款打印機，以在創傷修復、組織再生、癌癥藥篩等領域開展臨床試驗。
該成果的優勢在于，可以提升干細胞的利用率和可移植面積，實現干細胞微球在受損器官部位的原位 3D 打印，并能成功修復重度骨骼肌創傷。
同時，還能實現毛囊的再生，有望用于大面積皮膚創傷和軟器官損傷修復。而且，全自動化的 3D 打印流程，還能解決當前醫療資源匱乏等問題。
借助這款打印機，在大面積皮膚燒傷的修復上，研究人員已對缺少 40% 表皮的小鼠皮膚實現了再生修復。
（來源：Nature Communications）
未來，打印機還能內嵌不規則創面 3D 掃描儀，對不規則創面進行 3D 掃描重建，實現對于不規則創面組織的全自動化 3D 打印。
再通過原位生成干細胞微球、創傷區域掃描重建、干細胞微球原位 3D 打印等手段，就能對大面積燒傷病人進行再生修復。
在脂肪填充等美容領域，干細胞微球間隙式移植技術可以同時移植干細胞微球和無細胞微球，通過干細胞的高遷移性，能從宏觀層面上實現干細胞利用率的最大化。
未來，干細胞微球和無細胞微球還有望形成干細胞微球組，從而用于脂肪填充，鎖住脂肪以避免其流失。同時，干細胞微球組還具備抗老化的功能，故也能用于美容等領域。
近日，相關論文以《噴氣式打印使稀疏間充質干細胞圖案化增強骨骼肌和毛囊再生》（Bead-jet printing enabled sparse mesenchymal stem cell patterning augments skeletal muscle and hair follicle regeneration）為題發表在 Nature Communications 上 [2]。
圖 | 相關論文（來源：Nature Communications）
清華大學清華-伯克利深圳學院 2019 級碩士生曹遠雄是第一作者，馬少華擔任通訊作者。論文也被期刊編輯選取為 Biotechnology and methods 領域內的亮點文章。
圖 | 從左至右：馬少華、曹遠雄（來源：資料圖）
1 月內實現功能性修復，3 周內實現毛囊再生
據介紹，該團隊長期致力于研究干細胞與類器官工程，曾發明一款級聯微流控微球制備技術，并已用于高通量腫瘤類器官制備、子宮內膜與肝臟修復。
基于此，他們實現了高通量、自動化的“智能化類器官-個體敏感藥物篩選”技術，將篩藥周期縮短至 1 周內，通量提高 10 倍以上。另外，其還曾研制一款類器官工程化的原創裝備。
而此次的噴氣式高通量干細胞微球 3D 打印機，則是級聯微流控微球制備技術，在再生醫學領域的又一探索。（來源：Nature Communications）
（來源：Nature Communications）
研究中，課題組耗時兩年左右完成從原型機到實驗室樣機的設計、優化、調試與組裝。其采用模塊化的設計思路來搭建 3D 打印樣機，只需先完成分模塊的調試，在所有模塊都完成優化后，再組裝起來進行整體樣機的全局匹配與調試。
打印機內嵌以下模塊：微流控制備模塊、3D 打印模塊、圖像捕捉模塊、以及微球噴射模塊，涵蓋生物、機械、材料、信息等多學科。
接下來，要對高密度干細胞微球間隙式移植技術進行體外測試，包括測試干細胞的生物活性、安全性、相容性等。
然后，他們還測試了不同細胞密度的增殖活性，借此篩選出最適合干細胞生長的細胞密度。
隨后，針對不同干細胞密度微球在遷移能力、代謝能力、干性維持能力以及外泌體分泌能力的區別進行比較，借此發現高密度干細胞微球可以提升干細胞生物活性、安全性和相容性。
下一步，則要測試打印機在重度骨骼肌創傷和毛囊再生修復上的效果。其中最重要的一項測試在于，對動物體內的組織創傷進行再生修復。
為此，他們選取不同的組織，來測試打印機的修復性能。對于重度骨骼肌的創傷，在 1 個月內實現了功能性修復；對于小鼠毛囊的損失，則在 3 周內實現了毛囊再生。
實驗結果表明，在損失組織的原位打印與再生上，這款打印機有著優良的性能。
但在當時，干細胞的再生修復機制仍然是個未解之謎。不過做科研本就需要迎難而上，課題組也決心闡釋干細胞體內的修復機制，這也是研究中最難的部分。
通過大量文獻調研，他們發現旁分泌作用和分化，是干細胞發揮作用的潛在機理。
為此，該團隊采用熒光標記法，對干細胞進行熒光標記與示蹤，然后將標記好的干細胞植入到體內，并在不同的時間點提取再生組織、進行組織切片與熒光成像，最終確定了干細胞在體內發揮的作用機制：即在植入干細胞的前期，干細胞會通過增殖與旁分泌發揮作用；在植入干細胞的后期，干細胞會通過分化來發揮作用。針對這一機理的解釋，也得到了三位審稿人的認可。
（來源：Nature Communications）
再接再厲：即將研發人工合成生物活性支架
另據悉，研究初期該團隊原本打算采用快速熱噴法，實現干細胞微球的無接觸打印，通過瞬時高溫產生的氣體膨脹，促成干細胞微球的噴射。
隨后，第一代原型機的設計與加工終于完成，其集成微流控模塊、3D 打印模塊、溫控模塊以及噴射裝置。
后來，他們測試了上述原型機的生物安全性，通過將干細胞微球快速熱噴射入培養基，并進行活死細胞染色。
測試結果表明，80% 以上的細胞因為瞬時加熱而死亡，對于這款原型機的生物安全性來說，這是一項極大的挑戰，也意味著將近一年的努力付諸東流。
但是研究團隊并沒有氣餒，再次翻閱大量文獻之后，他們決定改變思路研發第二代原型機，即通過采用高速流氣體，實現干細胞微球的 3D 打印。
鑒于上次的經驗教訓，他們把生物安全性作為首要的考慮因素，在初期就測試了高速流氣體對于干細胞微球的活死影響。
結果顯示，高速流氣體有著極高的生物安全性，氣體推動所產生的噴射力，對于干細胞微球的活死不會有任何影響，這也讓接下來的工作得以延續。最終完成了本次研究。
未來，他們還打算研發新型的人工合成生物活性支架，預計它能充分模擬細胞外基質微環境，并有望替代當前已有的商用基質膠產品。
